腦脊液檢查本身不痛苦，但把腦脊液要取出來需要有創操作，最常見的操作辦法是腰椎穿刺。腰椎穿刺的操作辦法是人躺在床上頭膝環抱位側身，暴露腰部的椎間隙，用細的鋼針一般在腰3/4或腰4/5之間的椎間隙穿進去，刺破蛛網膜，達到蛛網膜下腔，從這裡面抽取腦脊液進行化驗。

該穿刺過程需要打局麻藥，一般不打局麻藥會非常疼痛，但是打了局麻藥以後病人應該可以耐受，也不是非常疼。做完腰椎穿刺以後去枕平臥6小時，一般病人便不會再有疼痛感覺。